337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 用戶指南

——高效、靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）解決方案

一、產(chǎn)品概述

337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 是德國(guó)凱杰（QIAGEN）公司推出的高靈敏度實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液，專為基于SYBR Green染料的qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。該產(chǎn)品包含優(yōu)化配方的反應(yīng)緩沖液、高保真HotStart DNA聚合酶、dNTPs及SYBR Green I染料，適用于基因表達(dá)分析、SNP分型、病原體檢測(cè)等應(yīng)用場(chǎng)景。

核心參數(shù)：

• 貨號(hào)：337839

• 規(guī)格：25 mL（可滿足250次20 μL反應(yīng)）

• 保存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融

• 有效期：24個(gè)月（未開(kāi)封）

• 適用儀器：兼容Bio-Rad、Applied Biosystems、Eppendorf等主流qPCR儀

二、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 高靈敏度與特異性

• HotStart技術(shù)：化學(xué)修飾的DNA聚合酶在95℃高溫下激活，有效抑制非特異性擴(kuò)增，減少引物二聚體形成。

• SYBR Green I優(yōu)化：染料與雙鏈DNA結(jié)合效率高，熒光信號(hào)強(qiáng)，適用于低豐度模板的檢測(cè)（可檢測(cè)至單拷貝基因）。

2. 寬動(dòng)態(tài)范圍與高重復(fù)性

• 線性范圍：覆蓋7個(gè)數(shù)量級(jí)（101–10?拷貝），適用于絕對(duì)定量與相對(duì)定量分析。

• 批間差異：CV值<5%（基于NIST標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證），確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性。

3. 便捷性與兼容性

• 即用型配方：無(wú)需額外添加MgCl?、dNTPs或染料，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程。

• ROX校正選項(xiàng)：部分型號(hào)預(yù)混ROX染料，適用于需要ROX校正的儀器（如ABI 7500 Fast）。

三、操作指南

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 試劑與耗材

• qBiomarker SYBR Fluor Mastermix（貨號(hào)337839）

• 引物（終濃度100-900 nM，建議使用QIAGEN OligoPerfect Primer Design工具設(shè)計(jì)）

• cDNA模板（1-100 ng/反應(yīng)，根據(jù)目標(biāo)基因豐度調(diào)整）

• 無(wú)核酸酶水（Nuclease-Free Water）

• 八聯(lián)管或96孔板（建議使用白色不透明板以減少熒光信號(hào)損失）

2. 儀器設(shè)置

• 預(yù)變性：95℃ 5分鐘

• 40個(gè)循環(huán)：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒（退火溫度根據(jù)引物Tm值調(diào)整）

• 熔解曲線分析：60℃→95℃，每0.5℃采集一次熒光信號(hào)

• 溫度程序：

• 熒光通道：選擇SYBR Green通道（如ABI儀器為FAM/SYBR通道）。

（二）實(shí)驗(yàn)操作

1. 反應(yīng)體系配制（以20 μL體系為例）：

   
   

   成分	體積（μL）
   qBiomarker Mastermix	10
   正向引物（10 μM）	0.4
   反向引物（10 μM）	0.4
   cDNA模板	2
   無(wú)核酸酶水	7.2

   
   

2. 加樣與離心

• 使用多通道移液器加樣，避免氣泡產(chǎn)生。

• 離心（2000 × g，1分鐘）確保液體沉至管底。

3. 上機(jī)運(yùn)行

• 將八聯(lián)管或96孔板放入qPCR儀，運(yùn)行預(yù)設(shè)程序。

• 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，保存原始數(shù)據(jù)（Ct值、熔解曲線）。

（三）數(shù)據(jù)分析

1. Ct值判斷

• 推薦Ct值范圍：15-30（Ct>35需驗(yàn)證擴(kuò)增特異性）。

• 陰性對(duì)照（NTC）Ct值應(yīng)無(wú)擴(kuò)增（Ct>40或未檢測(cè)到）。

2. 熔解曲線分析

• 單一峰型（Tm值±0.5℃）表明特異性擴(kuò)增。

• 多峰或肩峰提示引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，需優(yōu)化引物或反應(yīng)條件。

3. 定量方法

• 絕對(duì)定量：使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，構(gòu)建已知濃度模板的Ct值與拷貝數(shù)關(guān)系。

• 相對(duì)定量：采用2?ΔΔCt法，以內(nèi)參基因（如GAPDH）歸一化。

四、使用技巧與高效操作

1. 引物優(yōu)化

• 使用QIAGEN OligoAnalyzer工具評(píng)估引物二聚體形成風(fēng)險(xiǎn)。

• 梯度PCR確定最佳退火溫度（Tm±5℃）。

2. 模板質(zhì)量控制

• 使用Nanodrop檢測(cè)RNA純度（OD260/280 1.9-2.1，OD260/230 >2.0）。

• 瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)RNA完整性（真核生物應(yīng)可見(jiàn)28S、18S、5S三條帶）。

3. 儀器校準(zhǔn)

• 定期使用NIST標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證儀器熒光檢測(cè)準(zhǔn)確性。

• 確保ROX校正功能正常（如適用）。

五、注意事項(xiàng)

1. 安全規(guī)范

• 避免反復(fù)凍融，分裝后保存。

• 操作時(shí)佩戴手套，避免交叉污染。

2. 操作細(xì)節(jié)

• 移液精度：使用校準(zhǔn)后的移液器，誤差<±1%。

• 加樣順序：先加Mastermix，再加引物和模板，最后加無(wú)核酸酶水。

3. 故障排除

• 無(wú)擴(kuò)增信號(hào)：檢查引物質(zhì)量、模板濃度及反轉(zhuǎn)錄效率。

• Ct值偏大：優(yōu)化退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間或提高模板投入量。

六、用戶評(píng)價(jià)與支持

• 用戶反饋：

• “qBiomarker Mastermix顯著降低了Ct值，提高了低豐度基因的檢測(cè)靈敏度。"

• “熔解曲線分析功能幫助我們快速識(shí)別非特異性擴(kuò)增，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。"